Escherichia कोलाई में amide-निकोटीनैमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड (NMN) उत्पादन

सार

डायबिटीज एक पुरानी और प्रगतिशील बीमारी है, जिसका लगातार बढ़ता प्रचलन है, दुनिया भर में हेल्थकेयर सिस्टम पर वित्तीय दबाव बढ़ रहा है। हाल ही में, इन्सुलिन प्रतिरोध, टाइप 2 डायबिटीज की पहचान, NAD ⁺ अग्रदूत in-निकोटिनमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड (NMN) के साथ इलाज किए गए चूहों में ठीक हो गई थी, कोई विषाक्त प्रभाव नहीं बताया जा रहा है। हालांकि, NMN का उच्च मूल्य टैग है, अधिक लागत प्रभावी उत्पादन विधियों की आवश्यकता है। यह अध्ययन Escherichia कोलाई में एक जैव-प्रौद्योगिकी NMN उत्पादन विधि का प्रस्ताव करता है। हम बताते हैं कि निकोटीनैमाइड (एनएएम) की उपस्थिति में पुनः संयोजक निकोटीनैमाइड फॉस्फोरिबोसिल ट्रांसफ़ेज़ (नम) और फ़ॉस्फ़ोरिबोसिल पायरोफ़ॉस्फेट (पीआरपीपी) सिंथेटेज़ की द्विभाजित अभिव्यक्ति लागत प्रभावी एनएमएन उत्पादन के लिए एक सफल रणनीति हो सकती है। H1ophilus ducreyi से NAMPT जीन ले जाने वाले प्रोटीन अभिव्यक्ति वैक्टर और L135I म्यूटेशन के साथ बेसिलस amyloliquefaciens से PRPP सिंथेटेस Escherichia col21 BL21 (DE3) pLysS में तब्दील हो गए थे। PYA8 मध्यम में विकसित इन कोशिकाओं में 0.1% NAM और 1% लैक्टोज के साथ पूरक एनएमएन उत्पादन बैक्टीरिया की संस्कृति (या 17.26 मिलीग्राम प्रति ग्राम प्रोटीन) की अधिकतम 15.42 मिलीग्राम तक पहुंच गया।

परिचय

अंतर्राष्ट्रीय मधुमेह महासंघ के अनुसार, 2017 में टाइप 2 मधुमेह वाले वयस्कों की संख्या 425 मिलियन थी, और यह 2045 तक 649 मिलियन तक पहुंचने की उम्मीद है। वैश्विक स्तर पर, स्वास्थ्य बजट का 12% (या $ 727 बिलियन) खर्च किया जा रहा है मधुमेह का इलाज करने पर। हाल के अध्ययन ने इंसुलिन प्रतिरोध, टाइप 2 मधुमेह की पहचान, माइटोकॉन्ड्रियल समारोह की गिरावट और एनएडी ^{+ के} स्तर के साथ-साथ एनएडी ⁺ / एनएडीएच अनुपात में कमी को भी उम्र बढ़ने में मनाया। एनएडी ⁺ सभी जीवित जीवों में मौजूद है और ऑक्सीकरण-कमी प्रतिक्रियाओं में एक प्रसिद्ध कोएंजाइम है। SADT1 और SIRT6 जैसे NAD ⁺ -निर्भर प्रोटीन डेसीलेटेस मेटाबॉलिक सेंसर के रूप में काम करते हैं, और डाउनस्ट्रीम मार्गों को विनियमित करते हैं, जो अंततः माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और इंसुलिन संवेदनशीलता को बहाल करते हैं। यह खोज उम्र बढ़ने के साथ जुड़े अन्य अपक्षयी रोगों के लिए NAD ⁺ प्रभावों के अनुसंधान डोमेन का विस्तार करती है, जैसे: हृदय, कैंसर, गठिया, ऑस्टियोपोरोसिस या अल्जाइमर रोग।

The-निकोटीनैमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड (NMN) NAD ⁺ बायोसिंथेसिस में एक मध्यवर्ती है जो निकोटिनमाइड (NAM) और फॉस्फोरिबोसिल पायरोफ़ॉस्फेट (PRPP) से निकोटीनैमाइड फॉस्फोरिबोसिल ट्रांसजेज़ एंजाइम (Nampt) (EC 2.4.2.12) में निर्मित होता है। अच्छी तरह से सहन किया जा रहा है, चूहों में लंबे समय तक प्रशासन के दौरान कोई साइड इफेक्ट की सूचना नहीं है, और उम्र से संबंधित शारीरिक गिरावट को रोकने के लिए, NMN उम्र बढ़ने के साथ जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता से उलट, और बचाव के द्वारा उच्च वसा वाले आहार-प्रकार 2 मधुमेह के इलाज में कारगर साबित हुआ। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में उम्र से संबंधित गिरावट का प्रभाव।

एनएएम आमतौर पर एनएडी ⁺ निस्तारण मार्गों में शामिल एंजाइमों द्वारा एनएमएन में परिवर्तित किया जाता है, जैसे कि नम। इस एंजाइम की क्रिया कोशिका में मुख्य NAD ⁺ एनाबॉलिक गतिविधि का गठन करती है। स्तनधारी या सूक्ष्मजीवों के न्यूक्लियोटाइड चयापचय और जैवसंश्लेषण का विनियमन आमतौर पर पीआरपीपी की खपत से होता है। पीआरपीपी रिबोस-5-फॉस्फेट से पेन्टोज फॉस्फेट मार्ग के ऑक्सीडेटिव और गैर-ऑक्सीडेटिव शाखाओं के माध्यम से निकलता है।

बैक्टीरिया में, एनएएम को अक्सर निकोटीनिमाइड द्वारा निकोटिनिक एसिड (एनए) में परिवर्तित किया जाता है, जिसे प्रीस-हैंडलर मार्ग में एकीकृत किया गया है, यह एस्चेरिचिया कॉलो का मामला भी है। स्तनधारियों में, निकोटिनामिडेस गतिविधि की सूचना नहीं दी गई थी; एनएएम को एनएएम फॉस्फोराइबोसिल ट्रांसफरेज एंजाइमों में से एक के बजाय एनएमएन में बदल दिया जाता है। यद्यपि अधिकांश बैक्टीरिया में एनएएम फॉस्फोरिबोसिल ट्रांसफ़रेज़ का अभाव होता है, यह एंजाइम हीमोफिलस डुकेरी और शेवेनेला वनडेंसिस में व्यक्त किया जाता है।

Escherichia कोलाई जैसे सरल और चयापचय बहुमुखी जीवों, अक्सर वांछित एंजाइमेटिक गतिविधि के साथ प्रोटीन की नियंत्रित अभिव्यक्ति के लिए जैव प्रौद्योगिकी में उपयोग किया जाता है। इस तरह के एंजाइमों के लिए डीएनए कोडिंग को अक्सर बैक्टीरिया द्वारा पेश किया जाता है जैसे कि नोवेगन से पीईटी प्रणाली। PET वैक्टर E7 जैसे T7 RNA पोलीमरेज़ को व्यक्त करने वाले जीवाणुओं में परिवर्तित हो जाते हैं। कोलाई BL21 (DE3)। एंजाइम अभिव्यक्ति नियंत्रण लाख प्रमोटर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो केवल लैक्टोज (एक कार्बन स्रोत के रूप में भी मेटाबोलाइज्ड) या इसके सिंथेटिक संरचनात्मक एनालॉग, इसोप्रोपाइल-1-थियो-ए-डी-गैलेक्टोप्रानोसोसाइड (आईपीटीजी) की उपस्थिति में अभिव्यक्ति को प्राप्त करता है। बढ़ती प्रक्रिया के दौरान निरंतर एकाग्रता के साथ, चयापचय नहीं किया जाता है)। चूंकि जीवाणु चयापचय बहुमुखी है, कार्बन स्रोत की भिन्नता और मध्यम पूरक एंजाइम सब्सट्रेट की एकाग्रता एक जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया में ध्यान में रखने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं।

NMN की वर्तमान उच्च मूल्य समस्या को संबोधित करने के उद्देश्य से, अपने पिछले काम में हमने बैक्टीरिया कोशिकाओं से शुद्धि विधि का प्रस्ताव रखा। आगे की प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए, जैसा कि हम केवल एक खमीर उत्पादन विधि प्रकाशित करने में सक्षम थे, यह अध्ययन Escherichia कोलाई में एक सरल और लागत प्रभावी NMN जैव प्रौद्योगिकी उत्पादन विधि का प्रस्ताव करता है।

परिणाम

जीवाणु परिवर्तन

Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 और Mus musculus से Nampt से नैटिव NVV के लिए उत्पन्न कई अमीनो एसिड अनुक्रम संरेखण, उच्च समानता (छवि। S1) को दर्शाता है, इन सभी एंजाइमों को एक जैव-प्रौद्योगिकीय प्रक्रिया के लिए उम्मीदवार बनाते हैं।

परिवर्तित ई । पीएटी 28 ए (एनएएमपीटी) जीन के साथ कोली कोशिकाएं पीटी 28 ए (+) प्लास्मिड्स द्वारा काबामाइसिन के साथ पूरक एलबी अगर प्लेटों पर कॉलोनियों का गठन करती हैं। अनियंत्रित जीवाणु कोशिकाओं के साथ टीकाकृत प्लेटों पर कोई कालोनियों का पता नहीं लगाया गया था। इन कॉलोनियों से अलग प्लास्मिड डीएनए के एग्रोज जेल वैद्युतकणसंचलन ने ई में नामपेट-पेट 28 ए, पीईटी 28 एए-एनएएनडीवी या पीईटी 28 एए-एचडीएनएडीवी प्लास्मिड्स की उपस्थिति की पुष्टि की। कोलाई DH5α (पूरक चित्र। S2A, लेन 2, 3, 4)। डीएनए बैंड ई से बैंड से मेल खाते थे। कोलाई BL21 (DE3) pLysS कोशिकाएं (सप्लीमेंट्री अंजीर। S2A, लेन 6, 7, 8), जिन्हें E से सीधे निकाले गए संगत प्लास्मिड से रूपांतरित किया गया था। कोलाई DH5α। अनारक्षित ई में । कोलाई BL21 (DE3) pLysS कोशिकाओं का उपयोग, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है, pLysS प्लास्मिड की उपस्थिति की पुष्टि वैद्युतकणसंचलन द्वारा की गई थी, एक बैंड जो 4886 बीपी (सप्लीमेंट्री अंजीर। 0 एए, लेन 5) की ज्ञात लंबाई से मेल खाता था।

(अधिक प्रायोगिक आंकड़ों के लिए, मूल वेबसाइट देखें: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0##ec14)